Einfluss des Traubenkonsums auf das menschliche Mikrobiom

May 12, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7706 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Im Laufe der Jahre haben sich zahlreiche Informationen angesammelt, die darauf hindeuten, dass der Verzehr von Weintrauben einen positiven Einfluss auf die menschliche Gesundheit haben könnte. Hier untersuchen wir das Potenzial von Trauben, das menschliche Mikrobiom zu modulieren. Die Mikrobiomzusammensetzung sowie Urin- und Plasmametaboliten wurden nach zwei Wochen einer eingeschränkten Diät (Tag 15) nacheinander bei 29 gesunden, frei lebenden männlichen (Alter 24–55 Jahre) und weiblichen Probanden (Alter 15) bewertet - Wochen eingeschränkter Diät mit Traubenkonsum (entspricht drei Portionen pro Tag) (Tag 30) und vier Wochen eingeschränkter Diät ohne Traubenkonsum (Tag 60). Basierend auf Alpha-Diversitätsindizes veränderte der Traubenkonsum die Gesamtzusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft nicht, mit Ausnahme der weiblichen Untergruppe, basierend auf dem Chao-Index. Basierend auf Beta-Diversitätsanalysen war die Artenvielfalt zu den drei Zeitpunkten der Studie ebenfalls nicht signifikant verändert. Nach zweiwöchigem Traubenkonsum war jedoch die taxonomische Häufigkeit verändert (z. B. weniger Holdemania spp. und mehr Streptococcus thermophiles), ebenso wie verschiedene Enzymspiegel und KEGG-Wege. Darüber hinaus wurden 30 Tage nach Beendigung des Traubenkonsums taxonomische, Enzym- und Signalwegverschiebungen beobachtet, von denen einige auf den Ausgangswert zurückkehrten und andere auf eine verzögerte Wirkung des Traubenkonsums schließen ließen. Stoffwechselanalysen bestätigten die funktionelle Bedeutung dieser Veränderungen, wobei beispielsweise 2′-Desoxyribonsäure, Glutaconsäure und 3-Hydroxyphenylessigsäure nach dem Verzehr von Trauben erhöht waren und nach der Auswaschphase wieder auf den Ausgangswert zurückkehrten. Interindividuelle Variationen wurden beobachtet und durch die Analyse einer Untergruppe der Studienpopulation veranschaulicht, die über den Studienzeitraum einzigartige Muster der taxonomischen Verteilung aufwies. Die biologischen Auswirkungen dieser Dynamik müssen noch definiert werden. Obwohl klar zu sein scheint, dass der Verzehr von Trauben den eubiotischen Zustand des Mikrobioms bei normalen, gesunden Menschen nicht stört, ist es wahrscheinlich, dass Verschiebungen in den komplexen interaktiven Netzwerken, die sich aus dem Verzehr von Trauben ergeben, physiologische Bedeutung haben, die für die Wirkung der Trauben relevant ist.

Der potenzielle Einfluss des menschlichen Mikrobioms, das aus über 3 Millionen Genen und etwa 1014 Mikroorganismen1 besteht, auf Gesundheit und Wohlbefinden ist tiefgreifend. In den letzten zwei Jahrzehnten haben bemerkenswerte Fortschritte in der Mikrobiomforschung die Werkzeuge und das Wissen bereitgestellt, um den Einfluss dieses „Gewebes“ auf die menschliche Gesundheit und Krankheit sinnvoll untersuchen zu können (vgl. 2). Wörter wie „präbiotisch“, „probiotisch“, „synbiotisch“, „Eubiose“ und „Dysbiose“ sind heute allgemein in den allgemeinen Wortschatz der Laienöffentlichkeit und der wissenschaftlichen Gemeinschaft integriert. Der Markt hat sich zu einer milliardenschweren Industrie entwickelt, in der durch die Bereitstellung von Produkten für Menschen und andere Säugetiere ein erhebliches Wachstum in der Zukunft erwartet wird.

Da allgemein Einigkeit darüber besteht, dass die Aufrechterhaltung eines „gesunden“ Darmmikrobioms für die menschliche Gesundheit wichtig ist, wurden die möglichen Auswirkungen der Ernährung umfassend untersucht3. Daher wurde die Modulation der Zusammensetzung des Mikrobioms sowie der Mengen der vom Mikrobiom erzeugten Metaboliten (wie Acetat, Propionat und Butyrat) durch den Verzehr von Proteinen, Kohlenhydraten, Fetten, Polyphenolen, Phytoöstrogenen usw. über die Nahrung beschrieben4.

Ein Bereich, der uns interessiert, ist der mögliche Einfluss von Trauben auf die Gesundheit. Der Verzehr über die Nahrung ist weit verbreitet, was sich in der Produktion von über 6 Millionen Tonnen pro Jahr allein in den USA widerspiegelt. Basierend auf klinischen Studien am Menschen oder an Tiermodellen durchgeführten Studien deuten die Ergebnisse auf eine Reihe von durch die Traube vermittelten Reaktionen auf Arteriosklerose, Entzündungen, Krebs, Magen-Darm-Gesundheit, Auswirkungen auf das Zentralnervensystem, Arthrose, Harnblasenfunktion und Sehkraft hin5.

Kürzlich haben wir mithilfe von Mausmodellen, die mit Nahrungstrauben versorgt wurden, bemerkenswerte Auswirkungen auf die Genexpression, die Verhinderung oder Verzögerung einer Fettleber und die Verlängerung der Lebensdauer6 sowie Auswirkungen auf die Kognition und Genexpression im Gehirn7 gezeigt. Obwohl ein wichtiger chemischer Bestandteil der Traube Resveratrol ist, dessen biologisches Potenzial ausführlich untersucht wurde8, werden nur geringe Mengen dieser Substanz über die normale menschliche Ernährung aufgenommen. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Traube über 1600 phytochemische Bestandteile9 enthält, von denen viele allein oder in Kombination eine Reaktion auslösen können. Daher ist es im Zusammenhang mit Ernährung und Gesundheit von größter Bedeutung, die Traube als vollwertiges Lebensmittel zu betrachten.

Angesichts des breiten Wirkungsspektrums, das mit dem Traubenkonsum einhergeht, haben wir uns vorgenommen, den möglichen Einfluss auf das menschliche Mikrobiom als mögliche mechanistische Grundlage zu untersuchen. In früheren Arbeiten führte die Behandlung der menschlichen Darmmikrobiota mit Gesamtpolyphenolen aus Traubenkernen zu einer Verschiebung der Profile kurzkettiger Fettsäuren (SCFAs) und relevanter mikrobieller Populationen10. Bei Mäusen, denen eine fettreiche Ernährung mit angereichertem Traubenpulver verabreicht wurde, wurde die Häufigkeit von Genen, die die mikrobielle Produktion von Butyrat regulieren, selektiv erhöht11. In unserer Mausarbeit wurde die Urinausscheidung der Darmmikrobiota-Metaboliten 4-Hydroxyphenylessigsäure, 5-Hydroxyindol, Glycerinsäure, Gluconsäure und Myo-Inositol abgeschwächt, wenn Trauben zu einer Standardnahrung hinzugefügt wurden, und die Darmmikrobiota-Metaboliten Gluconsäure, Scyllo -Inositol, Mannitol, Xylitol, 5-Hydroxyindol und 2′-Desoxyribonsäure waren im Urin erhöht, wenn Trauben zu einer fettreichen Diät hinzugefügt wurden12,13,14. Darüber hinaus haben Yang et al. in einer zweiphasigen Interventionsstudie am Menschen (vierwöchige Standardisierungsphase und eine vierwöchige Traubeninterventionsphase) festgestellt, beobachteten einen Anstieg des Alpha-Diversitätsindex des Darmmikrobioms (Shannon-Index) sowie einen Rückgang des Gesamtcholesterins und der Gesamtgallensäure15.

Unter Verwendung eines alternativen Protokolls und einer größeren Anzahl von Probanden berichten wir derzeit über einen Versuch am Menschen, bei dem normale, frei lebende Freiwillige zwei Wochen lang das Äquivalent von drei Portionen Weintrauben pro Tag konsumierten, gefolgt von einer Auswaschphase von einem Monat. Die resultierende Zusammensetzung des Darmmikrobioms wurde durch Stuhlanalyse beurteilt. Darüber hinaus wurde eine Auswertung der Metaboliten in Urin und Plasma durchgeführt.

Der Prozess wurde über einen Zeitraum von zwei Monaten durchgeführt. Vierzig normale, gesunde, frei lebende menschliche Probanden nahmen an dem Versuch teil, bei dem Plasma, Urin und Fäkalien nach zwei Wochen eingeschränkter Diät (Tag 15) und zwei Wochen eingeschränkter Diät, ergänzt durch das Äquivalent von drei Portionen, nacheinander gesammelt wurden Trauben pro Tag (Tag 30) und eine einmonatige Auswaschphase (Tag 60). Während des gesamten Studienzeitraums traten keine unerwünschten Ereignisse auf. 29 Probanden absolvierten alle Phasen des Versuchs.

Die Alpha-Diversität wurde untersucht, um den Reichtum (Anzahl) oder die Gleichmäßigkeit (relative Häufigkeit) des Mikrobioms der Studienpopulation an den Tagen 15, 30 und 60 zu beurteilen (Ergänzung 1). Wenn alle 29 Probanden für die Analyse zusammengenommen wurden, gab es keinen Unterschied in den Diversitätsindizes OTUs, Chao1 oder Shannon. Ebenso wurden bei Männern im Alter von 24–44 Jahren in der Studiengruppe keine Veränderungen beobachtet. Bei den Frauen in der Studiengruppe im Alter von 29 bis 39 Jahren wurde jedoch am 30. Tag (nach zweiwöchigem Traubenkonsum) ein Unterschied beobachtet, wo die d-Effektstärke von Cohen für den Chao-Test 0,836 und der p-Wert 0,114 betrug ( Gepaarter T-Test des Schülers). Ein Unterschied wurde auch beim Vergleich des Ausgangswerts (Tag 15) mit der Auswaschphase (60. Tag) beobachtet (Cohens d von 0,982 und ein P-Wert von 0,079).

Die anhand der Bray-Curtis-Unähnlichkeit bewertete Beta-Diversität wurde mithilfe von Hauptkomponentenanalysen (PCA) und Hauptkoordinatenanalysen (PCoA) berechnet und visualisiert (Ergänzung 2). Laut Clusteranalysen (95 %-Konfidenzintervalle) wurden an den Tagen 15, 30 oder 60 keine signifikanten Unterschiede beobachtet, wenn die Studienpopulation als Ganzes ausgewertet oder in Gruppen aufgeteilt wurde, die nur aus Männern oder Frauen bestanden.

Mikrobenarten, die in Proben aller 29 Probanden am 15., 30. und 60. Tag gefunden wurden, sind in Abb. 1A dargestellt. Zu den am häufigsten in der Darmmikrobiota vorkommenden Arten gehören Faecalibacterium prausnitzii, Prevotella copri, Bacteroides stercoris, Alistipes putredinis, Bifidobacterium jugendlichis, Eubacterium rectale, Fusicatenibacter saccharivorans, Bacteroides vulgatus, Alistipes finegoldii, Akkermansia muciniphila, Collinsella aerofaciens, Bacteroides uniformis, Bacteroides coprocola und Parabacteroides Merdae. Wie aus Vergleichen der Triplett-Balken in Abb. 1A hervorgeht, zeigt jeder Zeitpunkt bei jedem Individuum ein anderes Profil, was auf eine durch das Ernährungsprotokoll hervorgerufene Veränderung schließen lässt. Ein Überblick über die individuelle Variation der Diversität aller Arten an den Tagen 15, 30 und 60 kann anhand der in Abb. 1B gezeigten Flächendiagramme sowie der Übergänge in der mikrobiellen Zusammensetzung von Tag 15 bis 30, Tag 15 bis 60 usw. visualisiert werden Tag 15 bis 60, sind aus den Überlagerungen der Flächendiagramme in Beilage 3, Abb. S1 ersichtlich.

Diagramme zur Darstellung der Artenvielfalt. (A) Gestapelte Diagramme stellen die Vielfalt aller Arten in einzelnen Probanden von 1 bis 29 dar. (B) Flächendiagramme zeigen die Artenvielfalt unter den 29 Probanden an Tag 15, 30 und 60.

Vergleichende mikrobielle taxonomische Analysen für die gesamte Probandenpopulation für Tag 15 vs. 30, Tag 30 vs. 60 und Tag 15 vs. 60 sind in den Tabellen 1, 2, 3 dargestellt. Basierend auf starken p-Werten und Cohen-d-Werten, die auf eine Effektgröße im mittleren bis großen Bereich hinweisen, wurde davon ausgegangen, dass die in den Tabellen enthaltenen Auswahlen diejenigen sind, die am stärksten vom Ernährungsstatus beeinflusst werden. Für jeden Eintrag wird eine taxonomische Hierarchie sowie eine kurze funktionale Konnotation angegeben.

Bei jedem Vergleich wurden signifikante Veränderungen im Mikrobiom beobachtet. Insbesondere nach dem Verzehr von Trauben (Tag 30) war Streptococcus thermophiles, ein Probiotikum, das im Darm Milchsäure produziert, erhöht. Andererseits wurden Holdemania spp. reduziert, wie es bei vegetarisch ernährten Personen der Fall ist. Interessanterweise nahm die Holdemania-Häufigkeit 30 Tage nach dem Verzehr der Trauben zu, und bei Streptococcus thermophiles wurde keine Veränderung festgestellt. Beim Vergleich des 30-Tage-Zeitpunkts mit dem 60-Tage-Zeitpunkt wurde eine konsistente Zunahme der Häufigkeit von Organismen festgestellt, die mit der Produktion von Metaboliten wie kurzkettigen Fettsäuren verbunden sind. Dies deutet tendenziell auf eine verzögerte Reaktion auf den Traubenkonsum hin, da diese Verschiebungen in den Vergleichen Tag 15 vs. 30 oder Tag 15 vs. 60 nicht beobachtet wurden.

Wie oben wurde ein Vergleich der mit dem Mikrobiom verbundenen Enzymhäufigkeit für Tag 15 vs. 30, Tag 30 vs. 60 und Tag 15 vs. 60 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4, 5 bzw. 6 dargestellt. Auch hier wurden die Einträge auf der Grundlage starker p-Werte sowie Cohen-d-Werten ausgewählt, was auf eine Effektgröße im mittleren bis großen Bereich hinweist.

Die geringste Anzahl an Einträgen findet sich in Tabelle 4, wenn man Tag 15 mit Tag 30 vergleicht. Bemerkenswert ist jedoch, dass die Katechol-2,3-Dioxygenase, die als wertvoll für die metabolische Entgiftung angesehen werden kann29, erhöht war. Andererseits wurde die (3S)-Malyl-CoA-Thioesterase reduziert, was sich möglicherweise auf den Glyoxylatzyklus von Mikroorganismen auswirkt.

Beim Vergleich von Tag 15 mit Tag 30 und 60 ist eine bemerkenswerte Veränderung die Erhöhung der fehleranfälligen DNA-Polymerase, die die Fähigkeit besitzt, sich durch DNA-Schäden zu replizieren30. Wie oben können Enzymwerte, die sich in der Liste „Tag 30 vs. Tag 60“ ändern, aber nicht in der Liste „Tag 15 vs. Tag 30“ erscheinen, auf eine verzögerte Wirkung des Traubenkonsums zurückzuführen sein.

Schließlich wurde ein Vergleich der mit dem Mikrobiom verbundenen KEGG-Signalwege (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Stufe 3) für Tag 15 vs. 30, Tag 30 vs. 60 und Tag 15 vs. 60 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabellen 7 dargestellt. 8 bzw. 9. Auch hier wurden die Einträge auf der Grundlage starker p-Werte sowie Cohen-d-Werten ausgewählt, was auf eine Effektgröße im mittleren bis großen Bereich hinweist. Es wurde eine relativ geringe Anzahl von Signalwegveränderungen beobachtet.

Der Vergleich von Tag 30 mit Tag 15 weist auf eine Verstärkung der „Cysteinpeptidasen“ hin, die eine Schlüsselrolle bei der Hämoglobinhydrolyse, der Invasion von Blutzellen, dem Austritt und der Verarbeitung von Oberflächenproteinen spielen31, sowohl verstärkte als auch reduzierte „ABC-Transporter“, die an der Bewegung von Metaboliten zum Blut beteiligt sind Zelloberfläche32 und Reduzierung der „Narl-Familie“, einem sensorischen Transduktionsweg33.

Ein Vergleich von Tag 60 mit Tag 30 zeigt, dass „Oxidoreduktasen“ (eine große Klasse von Enzymen, die die Übertragung von Elektronen katalysieren34), „ABC-Transporter“ und „Nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS)“ die Synthese wichtiger Peptidprodukte aus einer Vielzahl von Standards katalysieren und nicht-proteinogene Aminosäuresubstrate35) und „Asparaginsäurepeptidasen“ (wichtige Stoffwechselprozesse in Mikroorganismen36).

Im Vergleich von Tag 60 und Tag 15 sind die „ABC-Pfade“ erneut reduziert und die Verstärkung von „NRPS“ und „Oxidoreduktasen“ bleibt erhalten. Die auffälligste Veränderung in diesem gesamten Datensatz ist die Verstärkung des „anoxygenen Photosystems“ in diesem Zeitraum. Dies ist etwas überraschend, wenn man bedenkt, dass anoxygene phototrophe Bakterien dafür bekannt sind, dass sie die Energie des Lichts nutzen, ohne Sauerstoff zu entwickeln. Es ist jedoch bekannt, dass einige Organismen im Dunkeln aerob wachsen und unter anaeroben Bedingungen eine biologische Sanierung widerspenstiger Farbstoffe, Pestizide und Schwermetalle durchführen37.

Das PLS-DA-Ergebnisdiagramm für Tag 15 vs. Tag 30 ist in Abb. 2A dargestellt. Wie man sehen kann, gibt es nur einen sehr geringen Unterschied zwischen den Werten der Plasmen von Tag 15 (grün) und Tag 30 (blau), mit einer Tendenz von Tag 30, sich in Richtung des oberen rechten Quadranten zu bewegen. Das Diagramm der OPLS-DA-Ergebnisse für Tag 15 vs. Tag 30 ist in Abb. 2B dargestellt. Hier besteht eine leichte Tendenz, dass sich die Proben vom 15. Tag links und die Proben vom 30. Tag rechts anhäufen. Es gibt jedoch offensichtlich keine Trennung zwischen den beiden Zeitpunkten.

(A) Diagramm der PLS-DA-Scores für Plasma von Tag 15 (grün) vs. Plasma von Tag 30 (blau), (B) Diagramm der OPLS-DA-Scores für Plasma von Tag 15 (grün) vs. Plasma von Tag 30 (blau) und ( C) S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen für Plasma am Tag 15 vs. Plasma am Tag 30. 1, Stearinsäure; 2, Glucuronsäure.

Das S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen zeigt die Verteilung der 59 identifizierten Plasmametaboliten (Abb. 2C). Die erhöhten und erniedrigten Metaboliten wurden alle mithilfe einer univariaten paarweisen Analyse auf signifikante Unterschiede zwischen den beiden Studientagen untersucht. Es wurde festgestellt, dass nur zwei Plasmametaboliten zwischen der eingeschränkten Diät (Tag 15) und der Traubendiät (Tag 30) statistisch signifikant verändert waren. Die Stearinsäure war im Plasma um 10 % erhöht (P < 0,05) und die β-D-Glucuronsäure war um 17 % erniedrigt (p = 0,003).

Das PLS-DA-Ergebnisdiagramm für Tag 30 vs. Tag 60 ist in Abb. 3A dargestellt. Im Vergleich zur Analyse von Tag 15 und Tag 30 gibt es eine geringfügig bessere Trennung der Ergebnisse zwischen den Proben von Tag 30 und den Proben von Tag 60, mit einer Tendenz von Tag 30 nach links und Tag 60 nach rechts. Als ein OPLS-DA-Modell erstellt wurde (Abb. 3B), schien die Trennung etwas besser zu sein. Dies spiegelte sich im OPLS-DA-Beladungs-S-Diagramm (Abb. 3C) wider, in dem vier Metaboliten im Plasma am Tag 60 erhöht und einer erniedrigt waren. Interessanterweise waren drei Zuckerwerte erhöht, nachdem von der Traubendiät zurück zur eingeschränkten Diät gewechselt wurde: Glukose (+ 11 %, p = 0,007), Mannose (+ 16 %, p = 0,03) und Fruktose (+ 17 %, p = 0,008). , zusammen mit 2-Hydroxybuttersäure (+ 7 %, p = 0,01). Ein Metabolit war nach der Rückkehr von der Traube zur eingeschränkten Diät im Plasma erniedrigt – Milchsäure (– 17 %, p = 0,02).

(A) PLS-DA-Ergebnisdiagramm für Plasma am 60. Tag (blau) vs. Plasma am 30. Tag (grün); (B) Diagramm der OPLS-DA-Scores für Plasma von Tag 60 (blau) vs. Plasma von Tag 30 (grün); (C) S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen für Plasma am 30. Tag vs. Plasma am 60. Tag. 1, Glukose; 2, Mannose; 3, Fruktose; 4,2-Hydroxybuttersäure; 5, Milchsäure.

Das Diagramm der PLS-DA-Scores für den Urin von Tag 15 im Vergleich zu Urin von Tag 30 ist in Abb. 4A dargestellt. In diesem Ergebnisdiagramm zeigt sich eine Trennung zwischen den Urinen von Tag 15 und Tag 30. Als dies mithilfe eines OPLS-DA-Modells weiter untersucht wurde (Abb. 4B), wurde der gleiche aufkommende Unterschied zwischen eingeschränktem und Trauben-Diäturin beobachtet. Das OPLS-DA-Beladungs-S-Diagramm (Abb. 4C) ergab vier erhöhte Harnmetaboliten und zehn verminderte Metaboliten. Diese Unterschiede waren ausgeprägter als diejenigen, die bei den Vergleichsplasmaproben beobachtet wurden.

(A) PLS-DA-Score-Diagramm für Urin von Tag 15 (grün) vs. Urin von Tag 30 (blau); (B) Diagramm der OPLS-DA-Scores für Urin von Tag 15 (grün) vs. Urin von Tag 30 (blau); (C) OPLS-DA-Beladungs-S-Diagramm für Urin von Tag 15 vs. Urin von Tag 30. 1, Weinsäure; 2,2′-Desoxyribonsäure; 3, Glutaconsäure; 4,3-Hydroxyphenylessigsäure; 5, Valin; 6,3-Indolessigsäure; 7, Ribose; 8,2,3-Dihydroxybuttersäure; 9, Galaktose; 10, Glukose; 11, Hippursäure; 12, Carbaminsäure; 13, Malonsäure; 14, Levoglucosan.

Das Diagramm der PLS-DA-Scores für den Urin von Tag 30 im Vergleich zu Urin von Tag 60 ist in Abb. 5A dargestellt. Der eingeschränkte Urin und der Urin aus Traubendiät sind im PLS-DA-Score-Diagramm fast vollständig getrennt, und bei Anwendung des OPLS-DA-Modells wurde eine weitere Verbesserung erzielt (Abb. 5B). Wie im S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen (Abb. 5C) gezeigt, war ein Metabolit im Urin durch die Rückkehr zur eingeschränkten Diät erhöht und fünf Metaboliten waren verringert.

PLS-DA-Scores-Diagramm für Urin von Tag 30 (grün) vs. Urin von Tag 60 (blau) (A); Diagramm der OPLS-DA-Scores für Urin von Tag 30 (grün) vs. Urin von Tag 60 (blau) (B); S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen für den Urin von Tag 30 im Vergleich zu Urin von Tag 60. 1, Weinsäure; 2,2′-Desoxyribonsäure; 3, Glutaconsäure; 4, Ribonsäure; 5,3-Hydroxyphenylessigsäure; 6, Fumarsäure (C).

Schließlich dachten wir, es wäre von Interesse, eine Gruppe von Probanden, die die offensichtlichsten einzigartigen Profilverschiebungen auf der Grundlage der Bakteriengattung und -art aufweisen, auszusondern und diese Probanden mit dem Rest der Studienpopulation zu vergleichen. Dementsprechend wurden 11 Probanden ausgewählt, die die in Abb. 6 gezeigten Profilverschiebungen zeigten.

Willkürliche Auswahl von 11 Probanden basierend auf einzigartigen Profilverschiebungen von Gattung (A) und Art (B).

Basierend auf der Methode zur Auswahl dieser 11 Probanden ergab der Vergleich der Alpha-Diversität (Ergänzung 1, Abb. S1D) und der Beta-Diversität (Ergänzung 2, Abb. S1D) mit den verbleibenden 18 Probanden erwartungsgemäß keine signifikanten Unterschiede. Wie jedoch in Ergänzung 3 zusammengefasst, zeigte der Vergleich von Tag 15 mit Tag 30 und Tag 15 mit Tag 60 dieser 11 Probanden mit den verbleibenden 18 Probanden signifikante Unterschiede in Bezug auf taxonomische, Enzym- und KEGG-Signalwegvergleiche. Beispielsweise waren im 15-Tage-Vergleich mit 60 Tagen die Häufigkeit von Erysipelotrichia, Erysipelotrichales, Erysipelotrichaceae und Ruminococcus verändert (Ergänzung 3, Tabelle S1), ebenso wie drei KEGG-Wege (Ergänzung 3, Tabelle S2) und 13 Enzyme ( Beilage 3, Tabelle S3).

Ein Vergleich von Tag 30 und Tag 60 (Ergänzung 3, Tabelle S4) ergab, dass sich die folgenden Taxa deutlich unterschieden: Klasse: Coriobacteriia (Gallensäurestoffwechsel38), Ordnung: Coriobacteriaceae (Gallensäurestoffwechsel39), Familie: Coriobacteriaceae (Gallensäurestoffwechsel40), Gattung: Collinsella (Collissella wurde mit entzündungsfördernder Dysbiose bei Typ-2-Diabetes und mit zirkulierendem Insulin in Verbindung gebracht, was auf einen Mechanismus zur Förderung der NAFLD-Pathologie hindeutet41), Art: Collinsella aerofaciens (C. aerofaciens ist der Hauptverwerter von Laktose im menschlichen Dickdarm . Mehrere Studien zeigten, dass Collinsella und Bifidobacterium die Gallensäuren des Wirts modifizieren können, um die Virulenz und Pathogenität von Darmpathogenen zu modulieren42). Dementsprechend wurden bei den Vergleichen von Enzymen und KEGG-Signalwegen am 30. und 60. Tag mehrere signifikante Unterschiede beobachtet (Ergänzung 3, Tabellen S6 und S7).

Die Kluft in der taxonomischen Häufigkeitsvariation war im Vergleich der ausgewählten Probanden am 15. und 60. Tag mit dem Rest der Gruppe weniger ausgeprägt (Ergänzung 3, Tabelle S7). Es wurden jedoch viele signifikante Unterschiede bei den Enzymspiegeln (Ergänzung 3, Tabelle S8) und den KEGG-Signalwegen (Ergänzung 3, Tabelle S9) beobachtet.

Schließlich wurden vergleichende metabolische Analysen der beiden Untergruppen mit OPLS-DA zum Zeitpunkt Tag 30 (nach dem Traubenkonsum) untersucht. Wie in Abb. 7 dargestellt, kann die ausgewählte Gruppe von 11 Probanden anhand der OPLS-DA-Score-Diagramme mit Urin- und Plasmaproben von den übrigen 18 Probanden unterschieden werden. Univariate Datenanalysen von Plasma- und Harnmetaboliten, von denen angenommen wurde, dass sie aus der Mikrobiota stammen, zeigten jedoch keinen großen Unterschied zwischen den beiden Gruppen, abgesehen von Myo-Inositol im Plasma, das etwas verringert war (p = 0,03) (Ergänzung 4).

Plasmaprobe OPLS-DA bewertet Diagramme der ausgewählten Gruppe von 11 Probanden (rot) im Vergleich zu den verbleibenden 18 Probanden (grün), bestimmt mit Plasma- (A) und Urinproben (B).

Während das Darmmikrobiom eines gesunden Menschen relativ stabil ist, kann eine Dysbiose zu gesundheitlichen Problemen wie Morbus Crohn, Autoimmunerkrankungen, Dickdarmkrebs, Magengeschwüren, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleibigkeit führen oder damit verbunden sein. In der vorliegenden Studie unterschieden sich die menschlichen Probanden nach Geschlecht und Alter, es wurde jedoch davon ausgegangen, dass alle bei guter Gesundheit waren. Daher wurde erwartet, dass diese Personen die Studie in einem eubiotischen Zustand begannen, also mit einem Gleichgewicht zwischen nützlichen und schädlichen Bakterien. Unser Ziel war also nicht darauf ausgerichtet, eine bestimmte Veränderung herbeizuführen. Unser Ziel bestand lediglich darin, festzustellen, ob der Verzehr einer gängigen Nahrungsfrucht, beispielsweise der Traube, als Präbiotikum, Probiotikum oder Antibiotikum wirkte oder tatsächlich zu keiner größeren Veränderung führte. Dabei wurde die Ernährung im Anschluss an einen zweiwöchigen Zeitraum einer kontrollierten Diät für einen zweiwöchigen Zeitraum ergänzt, in dem ein genau definierter Traubenersatz, der drei normalen Portionen entsprach, täglich verzehrt wurde, und schließlich a eine einmonatige Auswaschphase, in der die kontrollierte Diät fortgesetzt, die Traubenergänzung jedoch abgebrochen wurde. Zu jedem dieser drei Zeitpunkte wurden Stuhlproben zur Analyse entnommen.

Wir untersuchten zunächst die Alpha-Diversität als breiten Hinweis auf den Reichtum (Anzahl) oder die Gleichmäßigkeit (relative Häufigkeit) der gesamten Studienpopulation. Am 15., 30. oder 60. Tag gab es keine wahrnehmbaren Unterschiede zwischen den Populationen (Ergänzung 1, Abb. S1A). Da die Alpha-Diversität je nach Geschlecht und Alter variieren kann43, haben wir unsere Probanden in Kohorten aufgeteilt und die Analyse wiederholt. Auch hier wurden keine größeren Unterschiede zu den verschiedenen Zeitpunkten beobachtet, außer bei Frauen im Alter von 29 bis 39 Jahren, wenn man den Ausgangswert mit dem 30. Tag (15 Tage Weintraubenkonsum) vergleicht, wo Cohens D-Wert für den Chao-Test lag 0,836 und der p-Wert betrug 0,114 (Student's gepaarter t-Test) und ein Vergleich der Grundlinie (Tag 15) mit der Auswaschphase (Tag 60), wo Cohens D-Wert 0,982 betrug, mit einem entsprechenden p-Wert von 0,079 (Ergänzung 1, Abb . S1B). Dieser Unterschied wurde bei männlichen Probanden nicht beobachtet (Ergänzung 1, Abb. S1C) und es gab auch keinen Unterschied beim Vergleich von Tag 30 und Tag 60 der weiblichen Gruppe (Chao-Test; Cohens D-Wert 0,047 und p = 0,93, Student's gepaarte t- prüfen).

Interessant ist, dass die Alpha-Diversität der Weibchen, die nach dem Weintraubenkonsum eine Veränderung zeigte, nach der 30-tägigen Auswaschphase nicht auf den Ausgangswert zurückkehrte. Die Auswirkungen dieser Verschiebung, sofern vorhanden, sind einer weiteren Untersuchung wert. Wir stellen fest, dass Yang et al.15 über eine signifikante Veränderung des Shannon-Index berichteten, als 19 Probanden über einen Zeitraum von 4 Wochen mit dem hier verwendeten Traubenersatz versorgt wurden. Das Geschlecht der an dieser Studie teilnehmenden Probanden wurde nicht angegeben, es wurde jedoch angegeben, dass die Altersspanne zwischen 18 und 55 Jahren liege und postmenopausale Frauen ausgeschlossen seien. Wir stellen außerdem fest, dass sich eine höhere Qualität der Ernährung möglicherweise in einer größeren Diversität der Darmmikrobiota widerspiegelt44, wie dies bei der weiblichen Gruppe unserer Studie beobachtet wurde.

Als nächstes untersuchten wir Beta-Diversität, Ähnlichkeit oder Unähnlichkeit an den Tagen 15, 30 und 60. Die Bray-Curtis-Unähnlichkeit wurde über PCA und PCoA berechnet und visualisiert. Wie in Beilage 2 dargestellt, wurde bei der Studienpopulation vor, während oder nach dem Traubenkonsum kein wesentlicher Unterschied beobachtet. Dies galt für die gesamte Studienpopulation sowie für Unterteilungen nach Geschlecht.

Basierend auf Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen kommen wir daher zu dem Schluss, dass der Traubenkonsum per se die gesamten gemeinschaftlichen Beziehungen der Mikrobiota mit dieser Studienpopulation nicht verändert. Im Gegensatz zu kontrollierten Tier- oder In-vitro-Studien gibt es bei der Untersuchung frei lebender Menschen erhebliche interindividuelle Unterschiede. Dies wird durch den Vergleich des ersten der in Abb. 1A (Tag 15) gezeigten Triplettbalken und der in Abb. 1B dargestellten zusammengesetzten Überlagerungen veranschaulicht. Nach dem Zeitraum des Traubeneingriffs (Tag 30) deutet der Vergleich der ersten beiden Balken von Abb. 1A (Tag 15 vs. Tag 30) in praktisch jedem Fall auf Veränderungen hin, wie durch einen Vergleich der zusammengesetzten Überlagerungen der entsprechenden Balken weiter veranschaulicht werden kann Tage (Abb. 1B). Basierend auf dem Studiendesign war die zweiwöchige Verabreichung von Nahrungstrauben der wahrscheinlichste Faktor, der zu diesen Veränderungen führte. Die letzten Balken der Tripletts veranschaulichen den Status der Mikrobiota nach Beendigung der Traubenverabreichung, ebenso wie die dritte Überlagerung. Die Frage, die zu diesem letzten Zeitpunkt angesprochen wurde, war, ob das Muster zu dem der vorherigen Traubenverabreichung zurückkehren würde oder ob etwaige Änderungen fortbestehen würden. Die Antwort scheint beim Einzelnen zu liegen.

Zunächst ist klar, dass sich die Häufigkeit der Bestandteile der Mikrobiota tatsächlich mit dem Eingriff in die Nahrungstrauben ändert, wie aus den zusammengesetzten Überlagerungen zu den verschiedenen Zeitpunkten hervorgeht (Ergänzung 3, Abb. S1). Zwischen allen drei Zeitpunkten bestehen Unterschiede. Eine detailliertere Untersuchung mit ausgewählten Probanden ist in Abb. 6 dargestellt. Aus diesen Beispielen können wir schließen, dass eine durch den Traubenkonsum hervorgerufene Verschiebung im Mikrobiom dauerhaft sein kann, wie die Probanden 1, 9 und 13 zeigen, und möglicherweise wieder auftritt Die Basislinie von 15 Tagen, wie sie von den Probanden 21 und 32 gezeigt wurde, zeigt keine offensichtliche Veränderung (Probanden 3 und 28) oder etwas dazwischen.

Vergleichende Analysen der Taxonomie der gesamten Studienpopulation zeigten signifikante Veränderungen in der Mikrobenhäufigkeit beim Vergleich von Tag 15 mit Tag 30 (Tabelle 1), Tag 30 mit Tag 60 (Tabelle 2) und Tag 15 mit Tag 30 (Tabelle 3). ). Entsprechende Änderungen der Enzymspiegel (Tabellen 4, 5, 6) und der KEGG-Signalwege (Tabellen 7, 8, 9) waren bei jedem Zeitvergleich mit den taxonomischen Verschiebungen verbunden. Um die physiologischen Konsequenzen dieser Effekte zu entschlüsseln, wurden Metabolomanalysen mit Plasma- und Urinproben durchgeführt, die von der Probandenpopulation zu jedem Zeitpunkt zur Untersuchung von Metaboliten bereitgestellt wurden, die vermutlich mit dem Mikrobiom in Zusammenhang stehen.

Bei Plasma zeigte das Diagramm der PLS-DA-Scores für Tag 15 und Tag 30 kaum einen Unterschied (Abb. 2A). In ähnlicher Weise zeigte das Diagramm der OPLS-DA-Scores keine klare Trennung zwischen den beiden Zeitpunkten (Abb. 2B). In Übereinstimmung damit zeigte das S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen die Verteilung der 59 identifizierten Plasmametaboliten (Abb. 2C), aber nur zwei [Stearinsäure um 10 % erhöht (P < 0,05) und β-D-Glucuronsäure um 17 erniedrigt % (p = 0,003)] zeigten statistisch signifikante Veränderungen.

Beim Vergleich von Tag 30 und Tag 60 im Vergleich zum Vergleich von Tag 15 und Tag 30 wurde im PLS-DA-Score-Diagramm (Abb. 3A) eine geringfügig bessere Trennung beobachtet, die durch die Erstellung eines OPLS-DA-Modells etwas verbessert wurde (Abb. 3B). Wie im OPLS-DA-Beladungs-S-Diagramm (Abb. 3C) gezeigt, waren drei Zucker nach dem Wechsel von der Traubendiät zurück zur eingeschränkten Diät erhöht [Glukose (+ 11 %, p = 0,007), Mannose (+ 16 %, p = 0,03) und Fruktose (+ 17 %, p = 0,008)], zusammen mit 2-Hydroxybuttersäure (+ 7 %, p = 0,01). Nach der Rückkehr von der Traube zur eingeschränkten Diät war die Milchsäure im Plasma erniedrigt (– 17 %, p = 0,02).

Der Anstieg von Glukose, Mannose und Fruktose nach dem Absetzen des Weinanbaus während der Auswaschphase nach dem Absetzen des Weinanbaus korreliert mit dem potenziellen Nutzen des Verzehrs von Trauben beim metabolischen Syndrom, wie in der Literatur berichtet45,46. In Übereinstimmung mit diesem Vorschlag haben wir berichtet, dass der Zusatz von Weintrauben sowohl zu einer Standardnahrung als auch zu einer fettreichen Ernährung bei Mäusen mit einer Hochregulierung des Malat-Aspartat-Shuttles und damit der Effizienz der Glukoseverwertung durch die Leber verbunden ist12. Darüber hinaus wird 2-Hydroxybuttersäure hauptsächlich in der Leber während der Glutathionsynthese produziert, und wir haben berichtet, dass diese Säure auch im Zusammenhang mit einer Traubenernährung bei Mäusen erhöht ist6.

Die Analyse des über einen Zeitraum von 24 Stunden gesammelten Urins ergab deutlichere Unterschiede beim Vergleich der Zeitpunkte der gesamten Probandenpopulation. Eine klare Trennung des Urins von Tag 15 gegenüber Urin von Tag 30 wird durch das PLS-DA-Score-Diagramm (Abb. 4A) und das OPLS-DA-Modell (Abb. 4B) veranschaulicht. Das OPLS-DA-Beladungs-S-Diagramm (Abb. 4C) ergab vier erhöhte Urinmetaboliten, deren Verstärkung als direkte Folge des Traubenkonsums angesehen wurde, da sie alle nach weiteren 30 Tagen einer traubenfreien Diät reduziert waren.

Die Weinsäure war am deutlichsten erhöht (fünffach, p < 0,0001). Da es sich um einen Bestandteil der Traube selbst handelt, kann dies als guter Indikator zur Überwachung des Traubenkonsums oder der Einhaltung einer Diät angesehen werden. Durch den Verzehr der Traubendiät war auch 2'-Desoxyribonsäure erhöht (+ 26 %, P = 0,009). Dieser Metabolit entsteht durch Hydrolyse von 2′-Desoxyribonolacton, das in der DNA durch Oxidation von 2′-Desoxyribose an abasischen Stellen gebildet wird, wobei die häufigste DNA-Läsion mit einer Rate von Tausenden pro Zelle und Tag auftritt. Dieser Prozess findet vorzugsweise an Stellen der DNA-Replikation statt, an denen der nacheilende DNA-Einzelstrang am anfälligsten ist, insbesondere für Depurinierung47. 2′-Desoxyribonolacton wird aus Duplex-DNA mit einer Halbwertszeit von 32 bis 54 Stunden freigesetzt, aus einzelsträngiger DNA jedoch schneller mit einer Halbwertszeit von etwa 20 Stunden48. Daher kann der Anstieg der 2′-Desoxyribonsäure nach dem Verzehr von Trauben eine Anhäufung von Ereignissen sein, die über viele Tage zuvor aufgetreten sind. Es ist auch möglich, dass es sich bei diesem Prozess um eine natürlich vorkommende DNA-Depurinierung handelt, deren Reparatur durch einen oder mehrere Traubenbestandteile verstärkt wird. Darüber hinaus beobachteten wir in zwei zuvor berichteten Untersuchungen zur Verabreichung von Trauben an Mäuse auch einen Anstieg der 2′-Desoxyribonsäure, der mit der Verabreichung einer Traubendiät verbunden war6,12, und in Interventionsstudien am Menschen wurden interindividuelle Unterschiede beobachtet49.

Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auch Glutaconsäure, eine weitere aus Glutamat abgeleitete 5-Kohlenstoff-Verbindung, nach dem Verzehr von Trauben erhöht ist (+ 26 %, p = 0,004). 3-Hydroxyphenylessigsäure, die mit dem Tyrosinstoffwechsel zusammenhängt, war ebenfalls erhöht (+ 44 %, p = 0,002). Andererseits war die Urinausscheidung von zwei Substanzen, die mit dem Metabolismus der Darmmikrobiota zusammenhängen, 3-Indolessigsäure und Hippursäure, sowie von Valin, Ribose, 2,3-Dihydroxybutansäure, Galactose, Glucose, Carbaminsäure und Malonsäure verringert und Levoglucosan.

Eine Untersuchung der Literatur ergab, dass der bakterielle Ursprung von Glutaconsäure Clostridium symbiosum50 und der bakterielle Ursprung von 3-Hydroxyphenylessigsäure Parabacteroides spp.51, Clostridia spp.52 oder Klebsiella pneumoniae53 sind. Diese Arten sind nicht in Tabelle 1 enthalten, in der die wichtigsten taxonomischen Veränderungen zusammengefasst sind. Tatsächlich ergaben nachfolgende Analysen, dass sich diese Arten in dieser Studienpopulation am 15. und 30. Tag nicht signifikant unterschieden (Ergänzung 5). Zur Klärung solcher Fragen sind weitere Arbeiten erforderlich, aber diese Dichotomie verdeutlicht den Wert der Metabolomik gegenüber der Mikrobiomie bei der Definition der tatsächlichen Produktion potenziell bioaktiver Metaboliten.

Die Analyse des Diagramms der PLS-DA-Scores für Urin von Tag 30 im Vergleich zu Urin von Tag 60 (Abb. 5A) und die OPLS-DA-Modellierung (Abb. 5B) zeigten eine noch deutlichere Trennung der Scores. Im S-Diagramm der OPLS-DA-Beladungen (Abb. 5C) war ein Metabolit im Urin durch die Rückkehr zur eingeschränkten Diät erhöht und, wie oben erwähnt, wurden die Metaboliten nach der Zugabe von Trauben zur Diät verringert.

Schließlich ist, wie oben erwähnt und in Abb. 6 dargestellt, klar, dass individuelle Variationen in einer frei lebenden Gruppe von Menschen erkennbar sind. Für den Zweck dieser Studie stimmte die Probandengruppe den Ernährungs- und Lebensstilbeschränkungen zu (Ergänzungen 6 und 7), damit wir die Auswirkungen des Traubenkonsums so genau wie möglich erfassen können. Das bedeutet jedoch nicht, dass wir von den einzelnen Personen erwartet hätten, dass sie völlig homogen reagierten. Basierend auf diesen Überlegungen hielten wir es für interessant, zunächst auf der Grundlage taxonomischer Profile des Mikrobioms ein bestimmtes Segment der Studienpopulation zu isolieren und diese ausgewählte Gruppe mit den anderen an der Studie teilnehmenden Personen anhand derselben Methodik zu vergleichen.

Von den 29 Teilnehmern, die die Studie abgeschlossen haben, wurden 11 Probanden aufgrund einzigartiger Profilverschiebungen von Gattung und Art beim Vergleich der drei Zeitpunkte ausgewählt (Abb. 6). Wie bei der gesamten Gruppe wurden auch bei den 11 ausgewählten Probanden keine signifikanten Unterschiede in der Alpha- und Beta-Diversität des Mikrobioms festgestellt. Allerdings wurden bei jedem Zeitvergleich (15 vs. 30; 15 vs. 60; 30 vs. 60) signifikante Unterschiede aufgedeckt, wenn die ausgewählten 11 Probanden mit den verbleibenden 18 Probanden hinsichtlich Taxonomie, Enzymspiegel und KEGG-Signalweganalyse verglichen wurden (Beilage 3). Um die funktionelle Bedeutung dieser Unterschiede zu bestätigen, wurde am 30. Tag (nach dem Verzehr der Trauben) mit OPLS-DA eine klare Trennung beobachtet, sowohl bei Plasmaproben (Abb. 7A) als auch bei Urinproben (Abb. 7B). Die vollständige chemische Natur dieser Stoffwechselveränderungen muss noch charakterisiert werden. Bisher hat unsere Analyse von Plasma- und Harnmetaboliten, von denen angenommen wird, dass sie aus der Mikrobiota stammen, nur die Identität von Myo-Inositol im Plasma ergeben, die etwas verringert war (p = 0,03) (Ergänzung 4).

Zusammenfassend zeigen die hier präsentierten Daten, dass der Verzehr von Trauben den eubiotischen Zustand des Mikrobioms bei normalen, gesunden Menschen nicht stört. Der Verzehr von Trauben verändert die taxonomische Zusammensetzung des Mikrobioms, die Enzymspiegel, die KEGG-Signalwege und das Metabolom. Wie es bei Arbeiten mit einer heterogenen Gruppe frei lebender Menschen üblich ist, wurden interindividuelle Unterschiede durch eine Unteranalyse der Studienpopulation nachgewiesen. Bei der gesamten Studiengruppe wurden jedoch durch den Traubenkonsum bedingte Veränderungen beobachtet, von denen man erwarten kann, dass sie allgemein gelten. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um festzustellen, ob diese Reaktionen für einen der gesundheitlichen Vorteile, die mit Weintrauben in Verbindung gebracht werden, verantwortlich sind oder damit zusammenhängen, obwohl es logisch erscheint, anzunehmen, dass Veränderungen dieser Art tiefgreifend genug sind, um von Bedeutung zu sein.

Das Ziel dieser Studie bestand darin, die potenziellen Auswirkungen des Traubenkonsums auf das Mikrobiom zu bestimmen, basierend auf der mikrobiellen Zusammensetzung des Mikrobioms und Metabolomics-Analysen. Um so viele Störfaktoren wie möglich zu entfernen, mussten die Probanden die in Anhang 6 beschriebenen Einschluss-/Ausschlusskriterien erfüllen. Da die Probanden die Kriterien erfüllten, wurde der Gesamtcharakter der Studie besprochen. Insbesondere wurden die mit der Studie verbundenen Diät- und Nahrungsergänzungsmittelbeschränkungen (beschrieben in Anhang 7) überprüft, und den Probanden wurde eine Kontaktnummer gegeben, unter der sie Fragen zu zulässigen Lebensmitteln stellen konnten. Zu diesem Zeitpunkt wurden Probanden, die eine Einverständniserklärung unterzeichneten, in die Studie aufgenommen.

Am ersten Tag der Studie erhielten die Probanden das erste Kit zur Stuhlprobenentnahme und begannen mit der Studiendiät. Sie wurden angewiesen, am 13./14. Tag eine Stuhlprobe zu entnehmen und das Testkit mit der Probe am 15. Tag (± 2 Tage) zurückzugeben. Darüber hinaus wurden die Probanden angewiesen, vor der Rückgabe der Stuhlprobe am 15. Tag 12 Stunden lang zu fasten, da an diesem Tag auch Plasma hergestellt werden sollte.

Am ersten Tag der Studie wurde den Probanden außerdem ein Urinsammelgefäß zur Verfügung gestellt. Etwa am 14. Tag der Studie entnahm jeder Freiwillige eine vollständige 0–24-Stunden-Urinprobe. Während der Entnahmezeit zu Hause wurde die Probe zwischen und nach jeder Entnahme gekühlt.

Am 15. Tag der Studie gingen die ersten Stuhltestkits ein. Alle Stuhlproben wurden gemäß den Diversigen-Richtlinien gesammelt, aufgezeichnet und für den Versand vorbereitet. Innerhalb von 24 Stunden wurden die Proben per Expresspost zur Analyse an Diversigen (New Brighton, MN) geschickt.

Darüber hinaus wurden die ersten Urinprobenflaschen entgegengenommen und von Hand geschüttelt, um die Homogenität sicherzustellen. Das Volumen wurde in ml gemessen und aufgezeichnet. Fünf ml wurden in 15-ml-Falcon-Röhrchen überführt, mit dem Code des Probanden, Datum und Uhrzeit sowie dem 24-Stunden-Urinvolumen beschriftet und vor der Analyse bei –20 °C eingefroren.

Die Probanden erhielten das zweite Stuhltestkit, ein zweites Urinsammelgefäß und ausreichend Traubenpulver, um den zweiwöchigen Zeitraum des Traubenpulverkonsums zu überstehen. Zusätzlich zur Bereitstellung von Anleitungsblättern (Beilage 8) wurden die Probanden in die Verwendung des Pulvers während der Studie eingewiesen. Kurz vor dem Verzehr vermischten die Probanden das Traubenpulver (36 g) mit etwa 170 ml Wasser. Dies wurde 14 Tage lang zweimal täglich (einmal morgens und einmal nachmittags/abends) durchgeführt. Falls eine Dosis vergessen wurde, wurde den Probanden geraten, diese so schnell wie möglich einzunehmen. Die Probanden erhielten ein tägliches Tagebuch, in dem sie den Produktverbrauch aufzeichnen konnten, und wurden angewiesen, am 30. Tag (± 2 Tage) die leeren Pulverbeutel zur Aufzeichnung zur Einhaltung mitzubringen.

Schließlich wurden mindestens 7 ml Vollblut in ein 10-ml-Röhrchen mit heparinisiertem Vacutainer (enthielt Natriumheparin) aufgezogen und bis zur Zentrifugation bei 4 °C für mindestens 15 Minuten bei 2200–2500 U/min auf Eis gestellt. Mit einer Pasteurpipette aus Glas (nur einmaliger Gebrauch) wurde die obere Plasmaschicht (3 ml) vorsichtig entfernt, ohne rote Blutkörperchen zu übertragen, und in ein Plastikröhrchen mit Schraubverschluss gegeben, das mit dem Code des Probanden sowie Datum und Uhrzeit beschriftet war. Die Proben wurden vor der Analyse bei –20 °C gelagert.

Am 30. Tag der Studie gaben die Probanden das zweite Stuhltestkit zurück, das eine in der jüngeren Vergangenheit gesammelte Probe und eine 24-Stunden-Urinsammlung enthielt. Die Proben wurden wie oben beschrieben verarbeitet und gelagert. Leere Beutel, die zuvor das Traubenpulver enthalten hatten, wurden zurückgegeben und die Probanden zu ihren Erfahrungen befragt. Die unerwünschten Ereignisse wurden gemeldet.

Es wurde Vollblut gesammelt und Plasma wie oben beschrieben hergestellt. Vor jeder Blutentnahme bestätigten die Probanden, dass sie mindestens in den letzten 12 Stunden gefastet hatten. Den Probanden wurde das dritte Kotprobenentnahmeset und das dritte Urinsammelgefäß ausgehändigt und sie führten die traubenfreie Studiendiät und die drogenfreie Diät für eine vierwöchige Auswaschphase fort.

Am 60. Tag (± 2 Tage) gaben die Probanden ihre endgültigen Stuhl- und Urinproben zurück, die für die Analyse vorbereitet wurden, und die endgültigen Plasmaproben wurden gesammelt.

Um die Konsistenz und Kontinuität der experimentellen und klinischen Forschung zum biologischen und physiologischen Potenzial von Weintrauben sicherzustellen, wird unter der Schirmherrschaft der California Table Grape Commission (Fresno, CA)54 ein gefriergetrocknetes Pulver hergestellt. Das Traubenpulver, das als Ersatz für frische Trauben dient, besteht aus frischen, entkernten und kernlosen roten, grünen und schwarzen Trauben, die gemahlen und gefriergetrocknet werden, um ihre bioaktiven Verbindungen zu erhalten. Das Pulver wird nach guten Herstellungsverfahren für Lebensmittel hergestellt. Eine weitere Qualitätssicherung erfolgt durch die Sicherstellung der Kontaminationsfreiheit des Produkts durch mikrobielle Analysen. Darüber hinaus unterliegt das Produkt einer chemischen Standardisierung zur Quantifizierung wichtiger phytochemischer Bestandteile54. Für die aktuellen Studien wurden vakuumversiegelte Packungen mit 36 ​​g standardisiertem gefriergetrocknetem Traubenpulver geliefert und bis zur Verwendung bei −20 °C gelagert.

Einundvierzig (41) Probanden wurden in die Studie aufgenommen und 29 Probanden (70,7 %) schlossen die Studie ab. Zwölf (12) Probanden (29,3 %) brachen die Studie ab. Fünf (5) Probanden (12,2 %) zogen ihre Einwilligung zurück, 3 Probanden (7,3 %) konnten nicht nachbeobachtet werden, 2 Probanden (4,9 %) waren auf UE zurückzuführen (Ausschlussmedikation erforderlich und Covid-19-Symptome) und 2 Probanden ( 4,9 %) waren auf Sonstiges zurückzuführen (ausschließende Medikamente und positiv auf Covid-19).

Das Durchschnittsalter (Standardabweichung [SD]) der Probanden betrug 39,8 (9,6) Jahre, wobei das Durchschnittsalter 40,0 Jahre betrug und das Mindest- und Höchstalter 20,9 bis 55,7 Jahre betrug. Zweiundzwanzig (22) Probanden (53,7 %) waren weiblich und 19 Probanden (46,3) waren männlich. Zu den Probanden gehörten Weiße/Kaukasier (40 Probanden, 97,6 %) und Andere (1 Proband, 2,4 %). Die Mehrheit der Probanden, 29 (70,7 %), waren keine Hispanoamerikaner oder Latinos und 12 (29,3 %) waren Hispanoamerikaner oder Latinos.

Das Studienprotokoll, die Probandeninformationen und das Einverständnisformular (ICF) sowie andere schriftliche Probandeninformationen wurden vom Institutional Review Board (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78,704 überprüft und genehmigt , Telefon: 512–326-3001, Fax: 512–697-0085, http://www.integreview.com.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt.

Die Proben wurden mit PowerSoil Pro (Qiagen) automatisiert für hohen Durchsatz auf dem QiaCube HT (Qiagen) extrahiert, wobei Powerbead Pro Plates (Qiagen) mit 0,5 mm und 0,1 mm Keramikperlen verwendet wurden.

Die Proben wurden mit dem Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen) quantifiziert.

Bibliotheken wurden mit einem Verfahren vorbereitet, das vom Illumina DNA Prep Kit (Illumina) übernommen wurde. Für BoosterShot® (Shallow Sequencing, 2 M Reads/Probe) wurden Bibliotheken auf einem Illumina NovaSeq mit Single-End 1 × 100 Reads (Illumina) sequenziert.

DNA-Sequenzen wurden nach geringer Qualität (Q-Score < 30) und Länge (< 50) gefiltert und Adaptersequenzen wurden mit Cutadapt gekürzt. Ablesungen menschlicher Wirtssequenzen wurden mit Bowtie2 entfernt.

Die Sequenzen wurden vor dem Alignment auf eine maximale Länge von 100 bp gekürzt und mit shi7 in ein einzelnes Fasta umgewandelt. DNA-Sequenzen wurden mit einer kuratierten Datenbank abgeglichen, die repräsentative Genome in RefSeq für Bakterien mit zusätzlichen manuell kuratierten Stämmen (Venti) enthielt. Die Alignments wurden mit einer Identität von 97 % gegenüber allen Referenzgenomen durchgeführt. Jede Eingabesequenz wurde mit jeder Referenzsequenz in der Venti-Datenbank von Diversigen unter Verwendung eines vollständig lückenhaften Alignments mit BURST verglichen. Der Gleichstand wurde gelöst, indem die Gesamtzahl der eindeutigen operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) minimiert wurde. Für die Taxonomiezuordnung wurde jeder Eingabesequenz der niedrigste gemeinsame Vorfahre zugewiesen, der über mindestens 80 % aller Referenzsequenzen mit dem besten Treffer hinweg konsistent war. Proben mit weniger als 10.000 Sequenzen wurden ebenfalls verworfen. OTUs, die weniger als ein Millionstel aller Marker auf Artenebene ausmachen, und solche, bei denen weniger als 0,01 % ihrer einzigartigen Genomregionen abgedeckt sind (und < 1 % des gesamten Genoms), wurden verworfen. Die Anzahl der Zählungen für jede OTU wurde auf die durchschnittliche Genomlänge normalisiert. Die Zähldaten wurden dann für jede Probe in die relative Häufigkeit umgewandelt. Die normalisierten und gefilterten Tabellen wurden für alle nachgelagerten Analysen verwendet.

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Orthology-Gruppen (KEGG KOs) wurden direkt mittels Alignment bei 97 % Identität anhand einer Gendatenbank beobachtet, die aus der Venti-Stammdatenbank abgeleitet wurde. Um diese Datenbank zu erstellen, wurde mit Prokka (Version 1.12) ein repräsentativer Stamm für jede Art in der Venti-Datenbank mit Anmerkungen versehen. Prokka-Anmerkungen wurden mit KEGG-IDs verknüpft, und Gensequenzen mit KEGG-Anmerkungen wurden zur Verwendung in der Funktionsdatenbank beibehalten. Die KO-Tabelle und die nachgeschalteten Tabellen enthalten die direkt beobachteten KO-Zahlen, umgewandelt in die relative Häufigkeit innerhalb einer Probe. KOs wurden auf KEGG-Pfade und KEGG-Module der Stufen 2 und 3 reduziert (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html).

Der Chao1-Index, der Shannon-Index und die beobachtete OTU-Anzahl (taxonomische Gruppe) wurden mithilfe einer verdünnten, gefilterten Taxonomietabelle berechnet, die mit QIIME 1.9.1 auf die für eine Stichprobe zulässige Mindesttiefe (10.000) eingestellt wurde. Bray-Curtis-Beta-Diversitätsmetriken wurden aus der gefilterten Taxonomie und der relativen Häufigkeit von KEGG-Modulen/Enzymen unter Verwendung von QIIME 1.9.1.2 berechnet.

Zunächst wurden 24 Qualitätskontrollproben (QC) vorbereitet, indem 50-μL-Aliquots aller Plasmaproben gepoolt wurden. Da für jede Probe mehrere Tests durchgeführt werden mussten und wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermieden werden sollte, wurde jede Probe in 200-μL-Aliquots aufgeteilt und in Eppendorf-Röhrchen gelagert. Die Proben wurden mit 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C… gekennzeichnet, wobei # = Probanden-ID und A = Tag 15 (± 2 Tage), B = Tag 30 (± 2 Tage) und C = Tag 60 (± 2 Tage). ). Die Proben wurden bei –20 °C gelagert. Alle Proben wurden doppelt und zusammen mit den QC-Proben analysiert. Diese wurden an sieben aufeinanderfolgenden Tagen in Gruppen von 30 und in einer randomisierten Reihenfolge analysiert. Am häufigsten wurden daher Duplikate von Plasmaproben an verschiedenen Tagen analysiert. Die Proben wurden mit BSTFA/TMCS derivatisiert und mit einem Agilent GC-MS-System unter Verwendung unserer zuvor beschriebenen Methoden analysiert12. Chromatografische Peaks wurden mit AutoQuant (Agilent) identifiziert, das ihre Massenspektren mit der NIST 14-Spektralbibliothek von 242.466 Massenspektren verglich. In Fällen von Unklarheiten, in denen verwandte Metaboliten ähnliche Massenspektren erzeugten, beispielsweise die isomeren Zucker Glucose, Galactose, Fructose und Mannose, wurden authentische Standards verwendet und die Peaks anhand ihrer Retentionszeiten auf der gaschromatographischen Säule identifiziert. Einige Komponenten erzeugten mehr als ein Derivat (und damit einen chromatographischen Peak), die summiert wurden. Die relative Konzentration jedes Metaboliten wurde aus dem Verhältnis seiner Peakfläche zur Peakfläche des internen Standards 4-Chlorphenylessigsäure bestimmt. Anschließend wurde mit Quant Browser eine Excel-Tabelle erstellt, die das Peakflächenverhältnis (relative Konzentration) aller identifizierten Metaboliten in allen Proben enthielt. Diese Datenmatrix wurde in SIMCA 17 importiert, um eine multivariate Datenanalyse durchzuführen.

Erstens wurde Harnstoff aufgrund seiner nachgewiesenen Dominanz in GC-MS-Chromatogrammen von derivatisiertem Urin aus allen Urinproben durch Inkubation mit Jackbohnen-Urease entfernt. Es wurde berichtet, dass dieses Verfahren die Anzahl der im Urin nachgewiesenen Metaboliten erhöht und deren Variationskoeffizient verringert55. Im Übrigen wurden die Urinproben an sieben aufeinanderfolgenden Tagen nach den gleichen Verfahren wie die Plasmaproben analysiert.

Diese Analyse wird auch als Projektion auf latente Strukturen – Diskriminanzanalyse – bezeichnet. Es handelt sich um eine überwachte multivariate Datenanalyse, das heißt, die Klasse jeder Stichprobe wird in die Analyse einbezogen. PLS-DA und andere überwachte Methoden unterliegen leicht einer Übermodellierung der Daten. Um eine solche Übermodellierung abzufangen, wurden PLS-DA-Modelle einer Validierungsmethode unterzogen, bei der ein Leave-One-Out-Protokoll mit 200 Permutationen verwendet wurde. Der Abfall der Werte R2 (Korrelation) und Q2 (Vorhersagbarkeit) auf unter 0,3 bzw. 0 gibt die Gewissheit, dass die Daten in der PLS-DA-Analyse nicht übermodelliert wurden.

Diese Analyse verringert die Dimensionalität der PLS-DA-Score-Diagramme. Konsequente S-Diagramme der OPLS-DA-Beladungen zeigen die durch GC-MS bestimmten Metaboliten in Bezug auf ihre relative Häufigkeit (X-Achse) und ihre Korrelation zum OPLS-DA-Modell (Y-Achse). Die Ladungen im oberen rechten Quadranten stellen Metaboliten dar, die in der Testgruppe hochreguliert sind, und die im unteren linken Quadranten stellen Metaboliten dar, die in der Testgruppe herunterreguliert sind. Ladungen, die den grafischen Punkt (0,0) überspannen, stellen Metaboliten dar, die nichts mit der experimentellen Manipulation, z. B. einer Ernährungsumstellung, zu tun haben.

Nach der Generierung der oben beschriebenen Datensätze zeigte die visuelle Untersuchung der gestapelten Parzellen mikrobieller Arten einige einzigartige individuelle Profilverschiebungen (Abb. 1A und 6A). Dies führte in Kombination mit den größten beobachteten Unterschieden in den geometrischen Koordinaten von PCA-Diagrammen [Ergänzung 2, Abb. S2, Tafeln D(i)–D(vi)] zur Auswahl von 11 Probanden (sechs Frauen und fünf Männer). Es wurden Unteranalysen durchgeführt, in denen diese 11 ausgewählten Probanden mit den 18 verbleibenden Probanden verglichen wurden, wobei die gleiche Methodik wie oben beschrieben angewendet wurde.

Um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen im Zeitverlauf zu bestimmen, wurden gepaarte t-Tests mit Microsoft Excel durchgeführt. Darüber hinaus wurden Cohen-d-Werte (Effektgröße) berechnet, um verschiedene Gruppen zu vergleichen56. Die univariate Datenanalyse (Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rang-Test) wurde mit GraphPad Prism 9.3.1 zur Analyse der GC-MS-Metabolomik durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde auf einem Niveau von p < 0,05 definiert, obwohl in einigen Fällen p-Werte im Bereich von 0,05–0,10 zusammen mit der Cohen-D-Effektgröße angegeben werden56. Zusätzliche Methoden der statistischen Analyse sind im Text enthalten.

Da die Probanden die Aufnahmekriterien erfüllten, wurde der Gesamtcharakter dieser Studie im Detail besprochen. Dazu gehörten auch Einschränkungen bei der Ernährung und Nahrungsergänzung im Zusammenhang mit der Studie. Die Probanden erhielten eine Kontaktnummer, unter der sie Fragen stellen konnten. In die Studie wurden nur Probanden aufgenommen, die eine Einverständniserklärung unterzeichneten.

Das Studienprotokoll, die Probandeninformationen und das Einverständnisformular (ICF) sowie andere schriftliche Probandeninformationen wurden vom Institutional Review Board (IRB) IntegReview, 3815 S. Capital of Texas Hwy, Suite 320, Austin, TX 78704, überprüft und genehmigt , Telefon: 512-326-3001, Fax: 512-697-0085, http://www.integreview.com.

Alle Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde eingeholt.

Die für die aktuelle Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Repository des National Center for Biotechnology Information (NCBI) unter der Zugangsnummer PRJNA882649 verfügbar.

Kyoto-Enzyklopädie der Gene und Genome

Nichtribosomale Peptidsynthetase

Hauptkomponentenanalyse

Hauptkoordinatenanalyse

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Die Autoren danken TKL Research, Inc., 1 Promenade Boulevard, Suite 1201, Fair Lawn, NJ 07410, für die Verwaltung der Probandenrekrutierung und die Sammlung klinischer Proben.

Diese Arbeit wurde teilweise von der California Table Grape Commission unterstützt. Der Sponsor war nicht beteiligt: ​​an der Erstellung des Artikels; in der Sammlung, Analyse und Interpretation von Daten; beim Verfassen des Berichts; und in der Entscheidung, diesen Artikel zur Veröffentlichung einzureichen.

Immunologieprogramm, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Asim Dave

Hochschule für Pharmazie und Gesundheitswissenschaften, Western New England University, 1215 Wilbraham Rd., Springfield, MA, 01119, USA

Regisseur Beyoğlu, Jeffrey R. Idle und John M. Pezzuto

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Arnold & Marie Schwartz College für Pharmazie und Gesundheitswissenschaften, Long Island University, Brooklyn, NY, 11201, USA

Eun-Jung-Park

Medizinische Fakultät, UMass Chan Medical School – Baystate, Springfield, MA, 01199, USA

John M. Pezzuto

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Konzeptualisierung, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Methodik, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Software, AD, E.-JP und DB; Validierung, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; formale Analyse, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Untersuchung, AD, E.-JP und DB; Ressourcen, JMP und JRI; Datenkuration, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung, AD, E.-JP und JMP; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Visualisierung, AD, E.-JP, DB, JRI und JMP; Aufsicht, E.-JP. JRI und JMP; Projektverwaltung, JRI und JMP; Finanzierungseinwerbung, JRI, DB und JMP Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit John M. Pezzuto.

JMP ist Mitglied des wissenschaftlichen Beratungsausschusses der California Table Grape Commission. Alle übrigen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dave, A., Beyoğlu, D., Park, EJ. et al. Einfluss des Traubenkonsums auf das menschliche Mikrobiom. Sci Rep 13, 7706 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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Eingegangen: 22. September 2022

Angenommen: 08. Mai 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34813-5

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